Langmuir封面文章揭示聚苯乙烯微球表面抗體取向偶聯的一般方法和原理，

更好指導體外診斷試劑開發

? ? ? ?納米探針已經在體外診斷領域得到了廣泛的應用。然而在一般方法中，抗體通常是方向隨機地吸附或偶聯在納米顆粒載體上，其抗原識別位點容易被占用或受到空間位阻的影響，導致納米探針對抗原的特異性結合能力降低。為了改善抗體取向，使更多抗原結合位點充分暴露，研究者們提出了一系列新方法，代表性的技術包括利用抗體特殊位點（如Fc端寡糖鏈、鉸鏈區二硫鍵）、引入夾層蛋白（如蛋白A、蛋白G、蛋白L）、分子印跡、抗體融合His-tag等。這些方法通常操作步驟比較復雜，成本較高，或需要對抗體改性，或需要引入新的組分，不易向實際應用中轉化。

? ? ? ?近日，東南大學生物科學與醫學工程學院與南京東納生物科技有限公司的研究者共同開發了一種簡單的抗體取向結合在聚苯乙烯納米顆粒表面的方法，即基于大家熟悉的EDC/Sulfo-NHS交聯法，調整抗體和載體納米顆粒的反應pH，并將這一條件下制備的探針用于心肌肌鈣蛋白I 側向免疫層析檢測。結果表明，抗體結合量和結合取向以及抗原檢測靈敏度都得到了顯著提高。雖然調節pH值是優化抗體結合常用的手段,但本文首次深入探討了該手段增強抗體取向的機制,并揭示了抗體密度、電荷分布和親疏水性的重要性，物理吸附和化學偶聯速度以及其他因素對抗體取向的影響。當pH降至略低于抗體等電點時，一方面，抗體的電荷分布和親疏水區域分布更有利于其以“tail-on”取向；另一方面，抗體和載體間化學交聯速度減緩，提供了更長的窗口時間，使抗體在納米顆粒表面微環境的影響下更充分地調節取向。該方法提高抗體結合量的意義還在于，當抗體結合密度足夠高時，抗體能夠垂直緊密排列在載體表面，使探針結構更加有序和穩定。

圖1 熒光免疫層析測定cTnI，探針制備時抗體投料量: (A) 50μg; (B) 200μg；(C) 抗體的三個維度尺寸

圖2 (A) IgG1小鼠單克隆抗體(1IGY)的三維晶體結構。左上角:前視圖;右上角:側視圖;左下角:俯視圖;右下角:底部視圖。堿性和酸性氨基酸基團分別用藍色和紅色標記。(B) Fab 2和Fc片段上堿性和酸性氨基酸的數量。(C)(Fab)2和Fc片段在不同pH下的凈電荷量，忽略保守的糖鏈，電荷分布與pI的實測值不完全一致。

圖3 pH對抗體取向偶聯的影響及機制

? ? ? ?這一簡單、實用的方法適用于優化各種IgG型抗體的取向。充分探討在化學交聯過程中影響抗體取向的因素，也有助于更好地指導我們調節實驗條件，從而構建更高性能的探針，從而實現高性能的體外診斷試劑開發。

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文獻鏈接：

Doudou Lou, Lu Ji, Lin Fan, Yongxin Ji, Ning Gu, and Yu Zhang, Antibody-Oriented Strategy and Mechanism for the Preparation of Fluorescent Nanoprobes for Fast and Sensitive Immunodetection, Langmuir 2019, 35, 4860?4867

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