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新聞速遞:BMC獸醫學專業期刊發表東納生物快速熒光定量平臺檢測犬細小病毒新成果

日期: 2019-03-08
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BMC出版社獸醫學專業期刊發表

東納生物快速熒光定量平臺檢測犬細小病毒新成果

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隨著分子生物學的發展,聚合酶鏈式反應(PCR)技術、等溫擴增技術、基因芯片、探針雜交等技術已經廣泛應用于微生物檢測、感染性和遺傳性疾病診斷、基因表達及突變檢測等諸多領域的研究。然而,檢測結果的判斷主要依賴于傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測,該方法不但耗時費力,而且由于涉及核酸染料等,安全性問題也有待提高。目前雖然逐漸出現多種核酸檢測方法,然而基本受制于昂貴的儀器和試劑成本(如熒光定量PCR)或檢測靈敏度不高(比色法、濁度法)等因素的限制,難以真正普及到基層和實際臨床檢驗工作中。

近年來,磁分離已在生物測定的廣泛應用,磁性微球(磁珠)成為分子細胞生物學研究、分子診斷、免疫診斷及細胞分選中極為重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是東納生物的明星產品,其采用經典的核殼結構設計制造,內核為聚合物微球,外層為磁性物質,最外層采用特殊聚合物修飾,具有尺寸分布均一、表面負載量高、極短的磁響應時間、高的分散穩定性等特點,可以快速、高效地從樣本中分離出待測物,極大地提高檢測效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已廣泛應用于核酸提取、DNA捕獲與傳感技術、PCR產物純化、測序純化、核酸轉染、抗體純化、細胞分選、特定蛋白分離、化學發光檢測、模擬酶等諸多領域,獲得許多知名的大學、研究機構與臨床診斷實驗室研究人員的廣泛好評。

新聞速遞:BMC獸醫學專業期刊發表東納生物快速熒光定量平臺檢測犬細小病毒新成果

1MagBeadsTM系列磁性微球

基于東納生物研發團隊在MagBeadsTM系列磁性微球的研究基礎,東南大學生物醫學工程學院研究人員與東納生物合作開發出一種PCR產物磁珠法純化聯合快速熒光定量檢測試劑盒(PCR-LFIA),使用磁珠去除PCR產物中的引物二聚體,使用熒光微球作為熒光信號放大器,確保檢測的靈敏度和準確度。使用配套檢測平臺Nanoeasy 1700,可快速實現檢測結果數字化定量。該試劑盒在保持PCR特異性的基礎上,靈敏度可比普通PCR2~3個數量級,與熒光定量PCR相當,且不涉及有毒試劑,儀器簡便、易于攜帶,通過互聯網可實時共享測試結果。PCR-LFIA檢測法快速,靈敏,特異且安全,在疾病診斷、食品檢驗和環境微生物監測方面具有廣泛的應用潛力,尤其適合即時診斷(POCT)應用。

新聞速遞:BMC獸醫學專業期刊發表東納生物快速熒光定量平臺檢測犬細小病毒新成果

2:快速熒光定量檢測平臺Nanoeasy 1700和系列試劑盒

犬細小病毒(Canine?parvovirus)感染又稱病毒性腸炎、傳染性腸炎,它是一種接觸性、急性、高致死性的傳染病。該病多呈地方性流行,發病率為60%~100%,無明顯的季節性。犬細小病毒病由于其高傳染性、高發病率、高死亡率,且容易誤診而錯過最佳的治療時間,從而給養犬業、寵物及一些野生動物的飼養帶來了重大損失。目前實驗室常用的診斷方法主要包括電鏡與免疫電鏡(IEM)、病毒的分離鑒定(VI)、血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)、膠乳凝集試驗(LA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫層析試驗(ICA)、PCR法(包括普通PCR和和實時熒光PCR)等。上述方法都有各自的優點和不足。電鏡和免疫電鏡技術需昂貴的儀器設備和豐富的觀察經驗。病毒分離培養費時費力,實驗條件嚴苛且成本較高。應用較廣泛的HAHI法,需隨時準備新鮮的敏感紅細胞,且對糞便樣品容易誤診。ELISAICA法能實現病毒的快速檢測,但其敏感性和準確度都有待提高。PCR診斷方法靈敏度高、特異性強,并且能夠在病毒感染的早期快速檢測。但PCR法需要通過凝膠電泳設備(時間長、涉及有毒試劑)或熒光定量設備(試劑、儀器昂貴)。

有鑒于此,項目組研究人員以犬細小病毒(CPV-2)為檢測對象,優化出LFIA的最佳工作反應體系(100 μL)和反應時間(2 min)。結果顯示,PCR-LFIA法僅檢測到CPV-2,非CPV毒株均顯示陰性。檢測靈敏度為30 copies/μL,并且與常規PCR在臨床樣品中的檢測結果一致(22.6%陽性,14/62),Cut-off值為146。檢測結果通過Sanger測序和BLAST進一步驗證。從PCR步驟開始整個過程僅需約80分鐘。

研究成果發表在BioMedCentral出版社專業獸醫學研究期刊BMC Vet Res2019, 15: 30),相關成果已經申請國家發明專利。

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3PCR產物磁珠法純化聯合快速熒光定量檢測試劑盒(PCR-LFIA)研究示意圖

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4LFIA的工作反應體系和反應時間優化結果圖. aLFIA的工作反應體系優化(熒光成像圖);bLFIA的反應時間優化(熒光成像圖);cLFIA的工作反應體系優化(Nanoeasy 1700);dLFIA的反應時間優化(Nanoeasy 1700

新聞速遞:BMC獸醫學專業期刊發表東納生物快速熒光定量平臺檢測犬細小病毒新成果

5PCR-LFIA檢測CPV-2方法的建立. aPCR產物純化試劑盒在CPV-2擴增產物上的應用結果;b,快速熒光定量檢測平臺測試PCR產物純化結果

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6PCR-LFIA檢測CPV-2方法的特異性測試. aPCR結果使用瓊脂糖凝膠電泳驗證;b,快速熒光定量檢測平臺驗證PCR結果

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7PCR-LFIA檢測CPV-2方法的靈敏度測試. aPCR結果使用瓊脂糖凝膠電泳驗證;b,快速熒光定量檢測平臺驗證PCR結果;c,快速熒光定量檢測結果標準曲線

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8PCR-LFIA法檢測寵物犬糞便樣品結果

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系列核酸提取試劑盒

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