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東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務 ——TEM、NTA、WB與標記

日期: 2019-08-29
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外泌體是一類直徑在30-150 nm的細胞外囊泡,具有豐富的可檢測靶標(蛋白質,DNARNA,脂質等)且非常穩定,可以作為細胞間信號轉導的載體。外泌體不僅參與了細胞間通信,也影響了腫瘤的生長和轉移,腫瘤微環境的改變,免疫調節等,在人類健康和疾病的許多方面起著重要作用。

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?東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務         ——TEM、NTA、WB與標記

1 外泌體從宿主細胞中釋放并被受體細胞攝取。外泌體是宿主細胞中產生的多泡小體與細胞膜融合并釋放到細胞外的小囊泡,可通過與細胞膜融合(a)或被胞吞(b)進入受體細胞【1】

外泌體提取常用的樣本包括細胞培養上清及各種體液(血液、尿液等),針對這些樣本發展起來的分離技術主要有:超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、免疫磁珠法、沉淀法等,每種方法各有優缺點,如超速離心和密度梯度離心法提取的外泌體純度較高,是現有提取方法的金標準,但離心設備貴且樣本起始量大;而沉淀法雖可獲得較多外泌體,但受雜蛋白影響,純度較低。具體實驗中應使用哪種提取方法,需要實驗者根據實驗條件及實驗目的進行確定。

無論哪種外泌體分離方法都很難完全將外泌體與其他囊泡或大分子蛋白質復合體或其他雜質區分開,獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品,因此就需要證明分離得到的產物是否是外泌體,即對外泌體進行鑒定。2014年國際細胞外囊泡協會(胞外囊泡和外泌體研究領域的研究者和科學家組成的專業社會團體,是胞外囊泡研究領域最權威的學會之一)提出了外泌體實驗必須要做的最少實驗要求,并于2018年進行了更新修改,即目前的《MISEV 2018》。

關于鑒定方法,除了利用透射電鏡(TEM)鑒定形態、粒徑分析(Nanosight)鑒定粒徑分布和濃度之外,還要結合Western Blot檢測囊泡上的標志性蛋白,三者缺一不可。與14年版相比,MISEV 2018在檢測標志蛋白方面提出了更詳細的建議,需同時檢測待測囊泡不同類型的蛋白,如跨膜蛋白(CD9CD63CD81)、膜結合蛋白(TSG101ALIXHSP70等),同時強調了陰性對照在檢測外泌體樣本中的重要性【2】



東納生物擁有成熟的外泌體鑒定和檢測技術平臺,設備齊全,人員專業,

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?可以為客戶提供以下 常規技術服務 特色標記服務。



? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 服務內容? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

01外泌體的鑒定——透射電鏡(TEM

為確定分離、提取的“外泌體”是否有較典型的外泌體結構,需對其進行鑒定。外泌體在體液中通常為球形結構,但在電鏡下觀察常為杯狀或茶托狀,通過TEM能夠直接鑒定出樣品中“外泌體”的形態。


東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務         ——TEM、NTA、WB與標記

2采用透射電鏡觀察從HCT116細胞培養基上清中分離出的外泌體【3】


?02?外泌體的粒徑分析(NTA)

檢測提取后的樣品大小是否在外泌體常規的粒徑范圍也是鑒定的關鍵。納米微粒追蹤分析術(NTA)可以實時檢測外泌體的粒徑區間,與之相配套的NTA分析軟件計算出每例樣品中外泌體顆粒數,最終得到整個體系的顆粒粒徑分布和濃度信息,結合圖表直觀地得出結論,為外泌體的鑒定和定量提供了關鍵數據。



東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務         ——TEM、NTA、WB與標記

3納米微粒追蹤分析(NTA)。(aNTA對單個囊泡進行直接追蹤觀測 ;(b NTA分析

軟件根據對單個囊泡追蹤觀測的結果,進行粒徑計算,得到整個體系的粒徑分布及濃度信息 【4】


?03外泌體的Western Blot檢測及分析

按照MISEV 2018》的要求,優選了外泌體跨膜蛋白(CD9CD63CD81)、膜結合蛋白(TSG101HSP70ALIX等)、陰性對照(Calnexin)、內參(GAPDHβ-actin),可為客戶提供外泌體常見的Western blot檢測服務。


東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務         ——TEM、NTA、WB與標記

4 Western Blot檢測細胞外囊泡膜結合蛋白、跨膜蛋白等的表達情況 【5】

04外泌體的功能標記及檢測

東納生物擁有成熟的微納米及分子標記技術,可實現對外泌體的熒光標記、磁性納米顆粒標記、金納米顆粒標記從而實現熒光成像、磁共振成像、暗場成像以及免疫電鏡觀察,可以進行5 mm磁性微球或熒光微球標記從而進行流式細胞儀檢測,可以進行藥物以及其它功能分子的負載從而實現載藥外泌體的構建,還可以聯合成像標記與載藥從而實現基于外泌體的診療一體化系統。


東納生物推出外泌體檢測、鑒定與多功能標記服務         ——TEM、NTA、WB與標記

5 采用轉鐵蛋白修飾的磁性納米顆粒特異性標記外泌體,并進行磁分離提取和負載阿霉素,從而構建基于外泌體的磁共振成像和腫瘤治療的診療一體化體系,實現轉鐵蛋白靶向和磁靶向的腫瘤治療【6】


參考文獻

【1】????? Lin J, Li J, Huang B, et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. Scientific World Journal. 2015; 2015:657086. doi:10.1155/2015/657086

【2】????? Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.?Journal of extracellular vesicles. 2018; 7(1):1535750. doi:10.1080/20013078.2018.1535750

【3】????? Jung M K, Mun J Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2018; (131):e56482. doi:10.3791/56482.

【4】????? Shao H, Im H, Castro CM, et al. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chemical reviews. 2018; 118(4):1917–1950. doi:10.1021/acs.chemrev.7b00534

【5】????? Ying W, Riopel M, Bandyopadhyay G, et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 2017; 171(2): 372-384. doi: 10.1016/j.

【6】????? Qi H, Liu C,?Long L, et al. Blood Exosomes Endowed with Magnetic and Targeting Properties for Cancer Therapy. ACS Nano. 2016 ; 10(3):3323-33. doi: 10.1021/acsnano.5b06939.

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